經(jīng)過數(shù)百年的人工栽培，西紅柿已經(jīng)是一種重要的經(jīng)濟作物，而且紅色是西紅柿最主要的外觀質(zhì)量指標，并且紅色果實具有較高的營養(yǎng)價值和食用價值。

由于果色是由多個基因調(diào)控的，因此如何在番茄果色形成過程中進行精細檢測與分級，是一個亟待解決的科學問題。

果肉色澤是由多個重要的遺傳因子共同決定的，其中一些重要的調(diào)控因子如：rs,nor,Gr,Cnr,Nr,hp,t,Del,Aft,atv,Abg等的變異導致了不同的色澤。

西紅柿果皮的色彩比較單一，而且很容易進行分類，通常情況下可以將其分成兩種類型：彩色果皮和無色透明果皮。

彩色果皮對無色果皮具有顯性作用，由SIMYB12基因所控制，在果實的生長過程中，由于SIMYB12基因不能表達，因此不能在果皮中積累類黃酮。

SIMYB12基因在蘋果中的過量表達可使其在蘋果中呈彩色，且具有較強的貯運能力。

果實色澤的鑒別方法有目測和儀表兩種，直觀鑒別法是一種比較典型的、使用方便、基礎(chǔ)簡單的測色方式，它只適合于那些比較簡單的分類。

由于種皮顏色的變化幅度非常大，而且大部分都是連續(xù)的，因此直接鑒別法很難受到人類的干擾，很可能會忽視掉某些中間的過渡色，這對于準確的測量、分類和定量的分析是不利的。

儀器測定法則是利用各種設(shè)備，把顏色轉(zhuǎn)化成精確的數(shù)值，讓顏色數(shù)值化、具體化和可視化，這種方式操作簡單，耗時短，還可以對顏色進行更加準確的測量和分類。

色差儀被用于多種農(nóng)作物的果皮或果實的色澤的測定，例如櫻桃番茄、黃瓜和辣椒等。

隨著人們生活質(zhì)量的提升，鮮紅、無色、透明、果皮、果肉的粉色西紅柿的需求量越來越大，但有關(guān)其色澤的功能性標志及其精確檢測方法還鮮有報道。

祝光濤課題組前期工作中，首次發(fā)現(xiàn)粉果番茄SIMYB12編碼的啟動子前4kbp區(qū)域有603bp長片段，該片段將導致該區(qū)域的遺傳變異。

在此基礎(chǔ)上，以30個不同品種的番茄為材料，開發(fā)相應的基因座，開發(fā)相應的基因功能標記。

利用激光光譜法測定果實色澤之間的關(guān)聯(lián)性，實現(xiàn)對果實色澤的快速、精準識別，并探討果實色澤的判別臨界點。

國內(nèi)外關(guān)于SIMYB12單倍體形態(tài)調(diào)控果實色澤的研究較少，而基于SIMYB12單倍體形態(tài)構(gòu)建的遺傳多樣性及其在果實色澤形成中的作用機制尚無研究。

在此基礎(chǔ)上，以SIMYB12基因上與果實色澤相關(guān)的突變位點為切入點，通過構(gòu)建可重復使用的、可應用于凝膠阻滯實驗的、可檢測到果實色澤的多個遺傳變異的遺傳變異，從而建立果實色澤的精確、快速的鑒別方法，為果實色澤的遺傳改良及果實色澤的鑒別提供理論依據(jù)。

材料與方法

選擇泉州市農(nóng)業(yè)科學研究所收集的30份番茄種質(zhì)資源為供試材料，包括櫻桃番茄28份和紅色大果番茄2份，命名從編號P1~P30。

參考Saghai-Maroof等人的實驗結(jié)果，利用CTAB法對番茄幼苗進行了全基因組DNA的提取，用酶標記法測定DNA的含量。

祝光濤對番茄果實色澤基因SIMYB12進行了分析，發(fā)現(xiàn)該基因位于第1對
SL2.40ch01:70935936-70938394bp區(qū)間，且該區(qū)間前4kbp區(qū)域有603bp序列丟失。

當前，番茄參照基因組已經(jīng)升級至SL4.0，根據(jù)SIMYB12基因的最新注釋，從NCBI官網(wǎng)上下載了SIMYB12基因的最新拼接全基因組。

利用序列比較分析，找出SIMYB12基因與其丟失的10kbp的序列，在丟失的603bp的兩邊合適的地方，進行引物設(shè)計，使其具有適宜的尺寸。

通過Primer-Blast技術(shù)和NCBI技術(shù)比較，驗證引物的專一性，并將其提交給生工上海公司，以驗證其專一性。

PCR反應系統(tǒng)（15微升）:1微升的模板DNA,1.5微升的10xbuffer,0.6微升的dNTP,0.6微升的前、后兩個引物0.6微升，0.3微升的TaqDNA聚合酶，10.4微升的ddH_2。

PCR方法：在94℃下進行5分鐘的PCR處理，結(jié)果表明在94℃時，30秒時，在58.6℃時，30秒時，在72℃時，延長時間90秒，共35次；在72℃下延長10分鐘。

通過對實驗數(shù)據(jù)的分析，對各引物的PCR退火溫度進行了相應的調(diào)節(jié)，得出了最佳的PCR退火溫度。

瓊脂糖電泳法：以1.5%的瓊脂糖為基底，加入1%的gelred核酸染色劑，將DNA放大后的產(chǎn)品放入BerlowGelDoc膠體成像裝置中，對其進行觀測和攝影。

對每個樣品的擴增條帶進行計數(shù)，其中較大的條帶用1表示，較小的條帶用3表示，雜合用2表示，而缺少的資料用0表示。

在一個完全成熟的西紅柿中，在一周內(nèi)以3個點為中心，用色差儀測量出L,a,b,C,h的值，然后求出它們的平均。

每種試材各取3株，每株試材3次，五種色差計的測定結(jié)果有各自的含義：L代表黑白通道，0表示黑色，100表示白色。a代表紅綠通道，a>0表示顏色偏紅，a<0表示顏色偏綠，b代表黃藍通道，b>0表示顏色偏黃，b<0表示顏色偏藍。

C是指色澤的飽和性或純凈性，較高的色度性表示色澤較亮，h是一種色彩角度，它是指三種基礎(chǔ)色和它們之間的一種過渡色，0度代表著純紅色，120度代表著純綠色，240度代表著純藍色。

結(jié)果與分析

利用酶標儀，對提取的番茄種質(zhì)DNA展開了快速檢測，結(jié)果顯示樣品濃度OD26m/OD280nm范圍在1.81~1.99，比值低于1.9的樣品有10份。

比值高于1.9的樣品有20份，平均值為1.92，供試的30份番茄種質(zhì)DNA提取質(zhì)量均滿足后續(xù)常規(guī)PCR擴增要求。

從NCBI官網(wǎng)上獲取了番茄最近一期全基因組DNA片段，采用比較分析法，確定了其中603個堿基的缺失區(qū)域。

使用Oligo7來設(shè)計引物，在SIMYB12的上游丟失序列的區(qū)域中，使設(shè)計產(chǎn)物擴增碎片的尺寸為200~2000bp，此標記適用于在瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

本文以SIMYB12為對象，通過對16對引物進行分析，結(jié)果表明其中3對引物的擴增結(jié)果均不含丟失的序列，且在擴增結(jié)果中存在著碎片尺寸上的差別，不能作為鑒別丟失位置的有效方法。

其中5對引物定位在丟失區(qū)域中，能夠以單一的顯性方式檢測到丟失的基因，這5對引物都是顯性的。

除了A-13的擴增片段較大，檢測效果不佳外，其它的都可以很好的檢測到果肉的顏色，但是不能很好的分辨出無色的、透明的果肉和丟失的信息。

在這一區(qū)域GC的含量較少，使得PCR很難進行PCR，且通常采用普通的反應系統(tǒng)和熱處理條件。

以P1、P9、P53個材料為供試材料，在不同的退火溫度下，對4對共顯性標記進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A-10的擴增效果最好，最適合的退火溫度是58.6℃，最后將A-10選擇為SIMYB12基因的分子功能標記。

在30個材料中，18個材料在克隆到287個bp左右的特異性片段后，經(jīng)分子生物學分析，這些材料的果皮呈透明狀。

其中3個種質(zhì)在890個bp左右的區(qū)域內(nèi)進行了遺傳分析，結(jié)果表明該種質(zhì)具有明顯的純合性，并對種質(zhì)進行了分子分析，結(jié)果表明該種質(zhì)為彩色種質(zhì)。

另外9個材料中，分別出現(xiàn)了287個和890個bp的片段，表明該區(qū)域存在著一個雜合體，其性狀為花色性狀。

以30個不同品種為材料，采用色差計對其果色進行了測定，得到了其果色的L,a,b,c,h等指標。

在這兩個顏色空間中，通過對果皮顏色進行分析，最后利用三維坐標對Lab進行分析，將b≥45的果分類為彩色果皮，b<45的果歸類為透明果皮。

Ch值使用二維坐標分析，將顏色飽和度C>60的分類為彩色果皮，2種數(shù)據(jù)分析方法的歸類結(jié)果是相同的。

利用色差計，可以迅速地測定各種果實的色澤，而大多數(shù)果實的色澤則可以用Ch測定法進行鑒別。

在被測試的物質(zhì)中，用肉眼鑒別方法得到18個無顏色的、12個有顏色的；通過分子功能標記分析，獲得了18個無顏色、12個有顏色、3個顯性、9個雜合種。

根據(jù)測定的鎘含量，采用色差分析方法對20個無顏色的果實和10個有顏色的果實進行了鑒別。

結(jié)果表明，該性狀的遺傳變異與肉眼觀察結(jié)果的性狀一致，其中28個性狀與Ch鑒別結(jié)果一致，2個性狀不一致，其中P7、P8性狀不一致。

P7、P8是一種由SIMYB12基因突變所致的紫紅色西紅柿，其果實為彩色，但因為含有大量的花青苷，所以果實呈紫黑色。

討論與結(jié)論

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，SIMYB12的上游有603bp的突變位點，該位點可能會對SIMYB12的功能產(chǎn)生重要影響，是開發(fā)InDel的優(yōu)良位點。

參考祝光濤所發(fā)明的InDel分子標志，王仁漢等在32個常用的西紅柿試材上證實了2個不能擴大，而在16個小西紅柿上證實了正確的結(jié)果，其正確率為62.5%。

我們在此基礎(chǔ)上，對其進行改造，并對其進行PCR檢測，從而進一步提升其檢測效率和準確度。

在前期工作中，我們構(gòu)建的A-10功能性標簽在15μL普通反應系統(tǒng)中仍存在著難以放大的問題，后來我們將dNTPs添加至0.6μL，并對其進行了熱處理。

當采用53℃時，該方法的準確率可達66.7%，但因該方法中副帶數(shù)目過多而導致雜合類型的錯誤，在此基礎(chǔ)上將A-10的識別率提升至100%，克服了基因缺失區(qū)難以放大的難題。

紫紅色西紅柿P7、P8受花色苷代謝通路關(guān)鍵酶調(diào)控，使其果皮中的花色苷大量累積，從而使其色澤變紫。

不同色澤的西紅柿，只有紫紅色的色素與色差計所收集到的色素有差異，其他色澤的色素和紫紅色色素都是相同的。

在本試驗中，供試的2份紫色番茄材料的果皮屬于彩色果皮，但是色差儀的Lab或Ch測量值都屬于無色透明果皮的標準范圍。

由于項目組已搜集到的紫紅色西紅柿種質(zhì)均為單色，無法進行該部分比較實驗，所以紫西紅柿在色澤上的判別，只能依靠常規(guī)的視覺判別方法。

在常規(guī)情況下，通常采用視覺檢測方法來進行簡單的識別和歸類，然而果實的色澤變化幅度非常大，且大多呈現(xiàn)出連續(xù)的特征。

因此，直接鑒別方法很難受到人類的干擾，不適合對果實色澤進行準確的測定和分類，也很容易忽視某些中間的過渡階段。

在儀器測定方法中，所采用的色差儀具有自身的照明系統(tǒng)，它不會受到外部環(huán)境的影響，可以對兩種不同的色彩進行精確的測量，并且具有操作方便、無損的優(yōu)點。

通過對目測法和色差儀鑒定法測量結(jié)果與基因型的相符度進行對比，可以看出除了紫色西紅柿的基因型與儀表測量法不一致之外，其他的供試西紅柿材料中，目測法和儀表測量法測量結(jié)果與基因型的檢測結(jié)果都是一樣的。

這說明儀表測量法可以被應用到對非紫色西紅柿的測定，并且可以更準確地對不同果皮的顏色進行判斷，并對它們進行分類。

SIMYB12的變異位點較多，且各單體型對果色性狀的效應也不一致，因此我們利用該603bp的變異位點，設(shè)計了一個A-10的功能性分子標記，雖然不能全面反映果實色性狀，但可以應用于多數(shù)品種。

該項目的實施將為今后開展以果實色澤性狀為目標的遺傳改良提供重要的理論依據(jù)。